产品货号：
YTB4037
中文名称：
Bsu DNA聚合酶(大片段)
英文名称：
Bsu DNA Polymerase, Large Fragment
产品规格：
200U|1000U
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本制品是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis,Bsu) DNA聚合酶大片段，具有5'→3' DNA聚合酶活性，不具有3'→5'和5'→3'的核酸外切酶活性。Bsu DNA聚合酶大片段具有链置换(strand displacement)活性，常用于重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)，其等温扩增(isothermal amplification)的温度通常为37℃。
Bsu DNA Polymerase,Large Fragment是将枯草芽孢杆菌DNA聚合酶I的5'→3'核酸外切酶结构域(1-296 aa)删除后表达剩余蛋白序列而获得的。该酶保留了枯草芽孢杆菌DNA聚合酶I的5'→3'聚合酶活性，但是缺失了5'→3'核酸外切酶和3'→5'核酸外切酶活性。
重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)主要包括以下几个组分：重组酶(recombinase) T4 UvsX，重组酶载入因子(recombinase loading factor) T4 UvsY，Bsu DNA聚合酶大片段以及单链DNA结合蛋白(single-strand binding protein)T4 gp32。在ATP存在的情况下，UvsX与引物相结合，扫描DNA模板，寻找到与引物配对的核酸序列，一旦引物被定位到了DNA模板的同源序列，ATP水解产生ADP，ADP与UvsX的结合导致UvsX被gp32取代而从DNA模板上解离下来，gp32作为单链结合蛋白可以稳定被置换的DNA链的结构，Bsu DNA聚合酶大片段因引物与DNA模板的配对而进行引物的延伸和模板的扩增。重组酶载入因子T4 UvsY和拥挤试剂(crowding reagent) Carbowax20M的加入有利于UvsX与引物的结合，即有利于重组酶UvsX的载入。
百奥莱博的Bsu DNA Polymerase,Large Fragment催化延伸DNA模板的效果请参考图1。
图1.百奥莱博的Bsu DNA Polymerase,Large Fragment催化延伸DNA模板的效果图。使用本产品或竞争N公司的Bsu DNA Polymerase,Large Fragment，在20μL反应体系中加入图中指定量的本产品或N公司的Bsu DNA Polymerase,Large Fragment，37℃孵育15min进行反应。反应完毕后冰浴3～5min，75℃孵育20min以终止反应。取出5μL反应液，加入1μL 6X DNA Loading Buffer，然后进行15%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(180V电泳60min)；之后用Redye (D0140)室温染色15min，然后进行拍照记录。如图所示，本产品与N公司的产品相比，具有类似的催化效果。反应体系(20μL)：10mM Tris-HCl (pH7.9 at 25℃),50mM NaCl,10mM MgCl2,1mM DTT,125μM dNTP Mix,0.5μM Template/Primer (Template:5'-ATACATAGATACATAGACTGGCCGTCGTTTTAC-3/Primer:5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3')；Primer和Template按照YT483产品说明书中推荐的程序进行退火反应，之后以Primer/Template退火产物为底物，进行DNA模板的延伸。实际操作时不同实验条件获得的实验结果会略有差异，图中所示结果仅供参考。
保存：-20℃
25mM Tris-HCl (pH7.4),50mM NaCl,1mM DTT,0.1mM EDTA,50% (v/v) Glycerol.
One unit is defined as the amount of enzyme that will incorporate10nmol dNTPs into acid insoluble material in 30minutes at 37℃.
大肠杆菌表达枯草芽孢杆菌DNA聚合酶I基因(297-880 aa)获得的重组蛋白。
不含DNA内切酶和外切酶，不含核糖核酸酶。
10×Bsu Reaction Buffer：
100mM Tris-HCl (pH7.9 at 25℃),500mM NaCl,100mM MgCl2,10mM DTT.
75℃加热20分钟。
相关搜索：Bsu DNA聚合酶(大片段)，Bsu DNA聚合酶，Bsu DNA Polymerase, Large Fragment
Bsu DNA Polymerase,Large Fragment是将枯草芽孢杆菌DNA聚合酶I的5'→3'核酸外切酶结构域(1-296 aa)删除后表达剩余蛋白序列而获得的。该酶保留了枯草芽孢杆菌DNA聚合酶I的5'→3'聚合酶活性，但是缺失了5'→3'核酸外切酶和3'→5'核酸外切酶活性。
重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)主要包括以下几个组分：重组酶(recombinase) T4 UvsX，重组酶载入因子(recombinase loading factor) T4 UvsY，Bsu DNA聚合酶大片段以及单链DNA结合蛋白(single-strand binding protein)T4 gp32。在ATP存在的情况下，UvsX与引物相结合，扫描DNA模板，寻找到与引物配对的核酸序列，一旦引物被定位到了DNA模板的同源序列，ATP水解产生ADP，ADP与UvsX的结合导致UvsX被gp32取代而从DNA模板上解离下来，gp32作为单链结合蛋白可以稳定被置换的DNA链的结构，Bsu DNA聚合酶大片段因引物与DNA模板的配对而进行引物的延伸和模板的扩增。重组酶载入因子T4 UvsY和拥挤试剂(crowding reagent) Carbowax20M的加入有利于UvsX与引物的结合，即有利于重组酶UvsX的载入。
百奥莱博的Bsu DNA Polymerase,Large Fragment催化延伸DNA模板的效果请参考图1。
图1.百奥莱博的Bsu DNA Polymerase,Large Fragment催化延伸DNA模板的效果图。使用本产品或竞争N公司的Bsu DNA Polymerase,Large Fragment，在20μL反应体系中加入图中指定量的本产品或N公司的Bsu DNA Polymerase,Large Fragment，37℃孵育15min进行反应。反应完毕后冰浴3～5min，75℃孵育20min以终止反应。取出5μL反应液，加入1μL 6X DNA Loading Buffer，然后进行15%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(180V电泳60min)；之后用Redye (D0140)室温染色15min，然后进行拍照记录。如图所示，本产品与N公司的产品相比，具有类似的催化效果。反应体系(20μL)：10mM Tris-HCl (pH7.9 at 25℃),50mM NaCl,10mM MgCl2,1mM DTT,125μM dNTP Mix,0.5μM Template/Primer (Template:5'-ATACATAGATACATAGACTGGCCGTCGTTTTAC-3/Primer:5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3')；Primer和Template按照YT483产品说明书中推荐的程序进行退火反应，之后以Primer/Template退火产物为底物，进行DNA模板的延伸。实际操作时不同实验条件获得的实验结果会略有差异，图中所示结果仅供参考。
- RPA法等温扩增；
- RPA链置换的DNA合成；
- 随机引物法标记；
- cDNA第二条链合成；
- 单个dA的加尾。
| 组分 | 200U | 1000U |
| Bsu DNA聚合酶大片段(5U/μL) | 40μL | 200μL |
| 10×Bsu Reaction Buffer | 100μL | 500μL |
保存：-20℃
25mM Tris-HCl (pH7.4),50mM NaCl,1mM DTT,0.1mM EDTA,50% (v/v) Glycerol.
One unit is defined as the amount of enzyme that will incorporate10nmol dNTPs into acid insoluble material in 30minutes at 37℃.
大肠杆菌表达枯草芽孢杆菌DNA聚合酶I基因(297-880 aa)获得的重组蛋白。
不含DNA内切酶和外切酶，不含核糖核酸酶。
10×Bsu Reaction Buffer：
100mM Tris-HCl (pH7.9 at 25℃),500mM NaCl,100mM MgCl2,10mM DTT.
75℃加热20分钟。
- 由于缺乏3'→5'核酸外切酶活性，Bsu DNA Polymerase,Large Fragment不能切除3'未配对的突出末端，因而不适用于产生平末端。
- Bsu DNA Polymerase,Large Fragment 25℃时仍保留50%的DNA聚合酶活性，是相同温度下Klenow片段(3'→5' exo-)活力的两倍。
- Primer/Template杂合双链的退火。
将单链Primer和DNA Template等摩尔数混合，推荐的终浓度为10μM，90℃孵育1min，然后通过梯度降温至25℃退火形成Primer/Template杂交双链。推荐使用百奥莱博的Annealing Buffer for DNA Oligos (货号：YT483)，并按照该产品使用说明进行退火反应。退火后的双链可以直接用于后续实验，或在-20℃保存备用。 - 对于DNA模板链的延伸，参考下表在冰浴中配制反应体系。
成分 用量 Nuclease-Free Water 40μL Annealing Buffer for DNA Oligos (5X) 20μL DNA oligo A (50μM) 20μL DNA oligo B (50μM) 20μL 总体积 100μL
按照上述顺序依次加入各种试剂，混匀。如果所用的PCR仪没有热盖，滴加矿物油(mineral oil)以防止蒸发。 - 如下设置PCR仪进行退火反应：
步骤 温度 时间 说明 1 95℃ 2分钟 让oligo充分变性 2 每8秒下降0.1℃，降至25℃(注a) 约90分钟 退火 3 4℃ 长时间保持 暂时存放
注意：- 每8秒下降0.1℃，降至25℃的程序设置，以Bio-Rad的T100为例为：1.95℃,2:00;2.95o,0.08,-0.1℃ per cycle;3.GOTO step 2,700X;4.4℃,∞。
- 如果所用的PCR仪不具备下降0.1℃的功能，也可以设置为每90秒下降1℃。程序设置以Bio-Rad的T100为例为：1.95℃,2:00;2.95℃,1:30,-1℃ per cycle;3.GOTO step 2,70X;4.4℃,∞。
- 如果条件有限，也可以将水浴锅加热至95℃，把PCR管放在水浴锅中，或者把煮沸的热水加入到保温杯或保温瓶中，待水温降到95℃时放入PCR管。所用水量控制在1～2小时内自然降温至25℃左右。此方法的退火效果可能会比使用PCR仪略差一些。
- 每8秒下降0.1℃，降至25℃的程序设置，以Bio-Rad的T100为例为：1.95℃,2:00;2.95o,0.08,-0.1℃ per cycle;3.GOTO step 2,700X;4.4℃,∞。
- 退火结束后可以直接用于连接反应，也可以在-20℃冻存备用。如果退火结束后打算进行酶切等其它反应，最好用纯化试剂盒进行纯化，或者确保退火产物在反应体系中体积不超过5%，以避免Annealing Buffer对后续的酶反应体系的干扰。
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